Les techniques d’étude de la structure des membranes
Un nombre considérable d’expériences concernant l’architecture membranaire a été conduit sur les hématies de Mammifères. Ces cellules très différenciées constituent un excellent modèle biologique pour ce genre d’études, car elles ne contiennent plus aucun organite et leur seule membrane est la membrane plasmique, qui peut donc être aisément purifiée après hémolyse puis centrifugation (on parle de « fantômes » d’hématies) ; elles peuvent en outre être obtenues en très grandes quantités.
• Techniques d’homogénéisation et de fractionnement cellulaire : différents protocoles ont été mis au point afin d’obtenir, à partir de ces hématies, des vésicules membranaires dont la polarité est celle de la membrane plasmique de départ (vésicules dites « normales »), ou des vésicules dites « retournées », dont la polarité est inverse, c’est-à-dire que leur face externe correspond à la face interne de la membrane plasmique initiale.
• Étude de l’architecture des membranes : elle commence par la dissolution de la bicouche au moyen de détergents, puis l’identification de toutes les protéines membranaires est réalisée après une électrophorèse dénaturante . De même, l’analyse des différents lipides est faite grâce à la chromatographie . Cette approche globale est complétée par une analyse de l’architecture précise, c’est-à-dire la position exacte des lipides dans chaque feuillet membranaire et la manière dont les protéines sont disposées dans la bicouche (étude de l’asymétrie membranaire). Les protéines extrinsèques sont décrochées de la membrane par des traitements « doux » tels que des changements de pH ou de force ionique du milieu.
• Techniques de marquage radioactif ou chimique : il est possible de marquer enzymatiquement certains groupements fonctionnels des protéines ou des lipides grâce à des radio-isotopes (ou des composés fluorescents ; . Ceci se réalise soit sur des cellules entières et intactes, soit sur des cellules perméabilisées, soit enfin sur des vésicules artificielles « normales » ou « retournées ». Le marquage se faisant in vitro et l’accessibilité de ces groupements n’étant pas la même vis-à-vis du marquage, selon les 1 6 Biologie cellulaire en 30 fiches différentes situations, l’analyse des molécules marquées (après électrophorèse ou chromatographie) donnera des informations précieuses sur leur orientation dans la bicouche.
• Utilisation d’enzymes : l’analyse des protéines membranaires peut impliquer leur digestion par des peptidases spécifiques, suivie par l’électrophorèse des peptides obtenus. Les chaînes glucidiques portées par les protéines ou les lipides peuvent être décrochées par des glycosidases ; ces chaînes, tournées uniquement vers l’extérieur des cellules, ne sont en effet accessibles que sur des cellules entières ou des vésicules « normales » obtenues in vitro. De la même façon, les lipides sont digérés par des phospholipases, ce qui permet d’étudier leur asymétrie de répartition.